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    公开号:WO1992010202A1
    申请号:PCT/KR1991/000031
    申请日:1991-12-04
    公开日:1992-06-25
    发明作者:Kwon Haeng Lee；Hoon Chung；Choon Woo Lee；Chun Hee Chung
    申请人:Il-Yang Pharmaceutical Co., Ltd.；
    IPC主号:A61K36-00
    专利说明:
    [0001] 明 un 発明の名称
    [0002] 抗感瘙免疫増強効果のある蛋白多糖体 （G 009)
    [0003] 図面の «f 単な説明
    [0004] 第 1 図は本発明蛋白多糖類 G 009の糖顛分析ク ロ マ ト グラ .
    [0005] 第 2 図は本発明蛋白多糖類 G 009のア ミ ノ酸ク ロ マ ト グラ ム .
    [0006] 第 3 図は本発明菌株 IY 009 菌糸体の顕撖鏡写真であ る 。
    [0007] 発明の詳細な説明
    [0008] 本発明は抗腫瘙免疫増強効果のある蛋白多糖体に関する ものであ る。
    [0009] 本発明者等は新 し い抗展瘍、 免疫増強効果のあ る蛋白多糖体の探 索を 目的に して多数の担子菌類を各地域別に採集 し、 その担子菌類 が生成する蛋白多糖体の分建を試図 した。 その結果、 全羅南道海南 郡の頭^山一蒂において採集 した ガノ デルマ （Ganoderea)属に属 する担子菌類を適当な培地で培養 した ら 、 抗魇瘙及免疫増強効果の ある蛋白多糖体を生成す こ と が発見さ れた。 生成さ れた蛋白多糖 体を分離 しその理化学的性質及び生物学的性貧を検討 し た と 二 ろ .
    [0010] SUBSTITUTE SHEET これを抗腫瘙、 免疫増強効果のある蛋白多糖体 G 009 と命名 し、 これを生成する菌株をガノ デノレマ ノレシ ダ ゝ （Ganoderina ュ uci。。in ) IY 009 と命名 した。
    [0011] このガノデルマ ルシダム IY 009菌株は社団法人鞟国種菡協会に 5 1990年】 1月 22日付で寄託番号 KFCC-10709号で寄託された。
    [0012] 高等 Sに属する担子菌類から薬効成分である抗菌成分、 幻覚成分、 毒成分 . コ レステロール降下成分等に関 して研究 して来たが最近に 到リ抗瘙成分と免疫機能増加作用の研究が活発に進行されてい る の で担子菌類の重要性が高く なつ ている。
    [0013] 1ひ こ こ に本発明者等は抗癌成分及び免疫機能増強作用のある物質を分 泌する菌株を分離、液内培養してその薬理効果を研究中、今まで分離 同定されたガノデルマ属の種 （species) よ り 卓越 した抗癌効果及 び免疫増強作用 をもつ変種の菌株を分難 し菌糸体の液内培養方法を 確立し、 この培養された菌糸体から抽出 し 二成分の抗瘩効果及び免 Ιί 疫効果増強を確認した。 これに対し本発明者等は次の実施例及び实 験例で本発明を説明する。
    [0014] 実 旃_ 趔
    [0015] SUBSTITUTE SHEET の 雜
    [0016] 1) 菌株 ： ガノデルマ ルシダム菌株は全羅南道海南郡の頭儉 山ー带で採集 して分離、 同定 した。
    [0017] 2) 保存培地 ：ジャ ガイ モ デキ ス ト ロ ス 寒天 （Potato dex trose agar ： PDA) 傾斜培地 ； ジャ ガイモ デキ ス ト ロ ス寒天培地 （ Difco
    [0018] , L .5. A ) 39g を蒸留水に溶か して 1 に し 、 121nC に おいて 20 分 間高圧滅菌の後傾斜培地に作っ た。
    [0019] 液内培養用培地 ： 葡萄糖 50g，ペプ トン 20g, KHZ P04 0.87g,
    [0020] MgS04. 7H20 0.5g, FeClz .6H 0 】0eg, HnCi2.4H20 7mg, ZnSO-, 5H20 lOag, ZnC 2 4mg に蒸留水を加えて 1 β に し た，
    [0021] この ρΗ を 5.5 に調整 して 121で、 20 分間高圧蒸気で滅脔 し た
    [0022] 3) 培養 ： 保管中の菌株を PDA傾斜培地に移植 して 25± 1°Cに 7日間 成長させた後， 発育された菌糸 を無菌的に分離 して液内培養用培地 100alに入れて 500 ] 三角フ ラ スコ に移 し 25 ± 1 に おいて 18 Or pm で菌糸体が直径 3-5mB 程度の成熟 した菌塊 を成すま で 7-1ϋ 日 間 g 銎培養 した。 得られた菌塊を微細粉砕機で 10 秒間粉砕 し た後、 液 内培養用培地 lOOml の人っ た 500ml 三角 フ ラ ス コ に 52 (V/V) ず
    [0023] SUBSTITUTE SHEET つ接種し . 25± Cの温度においてオ ビタル震盪培養器 （回転半径
    [0024] 1吋 ビジ-ヨ ン科学 Co.)をもっ て 170 回転 分で 7 ョ 間震盪培養 した。
    [0025] 4) 蛋白多糖類の抽出及び分難
    [0026] 培養の終おつ た培養液全体を eOOOrpin で 15 分間遠心分離 した 後、 菌糸体だけを取っ て 'Z倍の容量 2.5N NaOH溶液に浸潤させた後室 温で 24 時間放置 して SOOOrpDv で ]5 分間遠心分離 し 、 上澄液を 取って永醋酸で Pfi 7·4に中和させた後、 ビスキ ング チューブ （
    [0027] Visking tube: Sigma，じ. S . )を利用 して 3 日間透析させた。 透析 透析の終わっ た後濃縮 して 3 倍のエタ ノ ールを加えて Cで 24時 間放置した後 S000回転で 15 分間遠心分離 して沈殿物を得た r こ の沈殿物を脱イ オン水に溶解して 6000回転で 15 分間遠心分銃 し て上澄液を濃縮し 凍結乾燥させて蛋白多糖類を分難 した
    [0028] 5) 蛋白多糖類の精製
    [0029] 上記の試料を水に溶解して過量のエタ ノ ールを加えた後得 られ†_沈 -殿物 ( '糸培養物 1300πϋ中） を取っ て水に再び溶解させ
    [0030] こ の試料用液をチ · イエ ィーセルコ ス （D£AE— Cej i u i ose . C ; - ϊ ;>r E SHEET Coiuran Cicm x 60cm) に適用 させた後水で溶出 し て得 られた溶出分 fij 200ml に同量の メ タ ノ ールを加え遠心分離 し て沈殿物 を エ タ ノ —ルで洗浄 した後減圧乾燥 して G] (2.1g) を得た： 上澄液 （400DIい はエタ ノ ール 100m Jを加えて遠心分離 し た後得 られた沈殿物を减圧
    [0031] S 乾燥 して G2 (0.42g)を得 . G2を除去 して残っ た上澄液 800mU:再び 再びエ タ ノ ール 800mlを加え て得られた沈殿物 を減圧乾燥 して ΰ 3 を得た G i (2.1g ) を水に溶解 し てセ フ ア デキ ス ジ - 10C (Sephadex G-100)に適用させて水で溶出 し た。 チュ ーブ 、o .25-33 の分劃物を凍結乾燥 して G4 (】 .5g)を得、 チュ ーブ o.34-44の分
    [0032] 10 物を合わせた G5 (0.3g)を減圧乾燥 して分離 し た G4を水再び溶解
    [0033] し て 0.15M セ タ フ" ロ ン （_ Cetave J on； C e t h y J t r i m c t h 1 annnoni uir bromide)と 0.1 M ボレー ト緩衝液 (Borate buf fer PH 8.0) ガ；同 で混合された溶液を同量加えた後、 0Hで PHを 9.0に調整 して 沈殿物 （G 7)と上澄液 （G6)を取っ た， G7に 2 の氷醋酸 を加えて瑢
    [0034] ！.: 解 した後 3倍の メ タ ノ ールを加えて沈殿物 を得た .
    [0035] こ 二 で得 られた沈殿物を メ ノ ールと ア ヤ に ン で洗浄 し た後減圧乾 燥さ せた （G8 ) t G8 を少 ¾の に 溶解 し て セ フ マ ス シ 一 二 ル ー
    [0036] SUBSTITUTE SHEET 4B (Sepharose CL-4B) に適用 させた後水で溶出 し て チューブ ^. 25-30 で G9 を得、 チューブ IVo.:n-46 で G10を得た c 実 験 例 1
    [0037] 杭 癌 実 驗
    [0038] 上で得た分劐物の肉種- 180 に対する活性実験は下記の如 く 行つ た 20-25g ICR 雄性マ ウスの腹腔内で 1 週間間隔に移植 して継代 した肉種- 180(Sarcoma-180) の細胞を実験用の腫瘙細胞と して使用 した。 マウス腹腔で 7 日間培養された肉種 - 180 の細胞 を腹水と 共に取っ て氷冷、 滅菌した食塩水を加えて 4000rpin で 5 分間遠心 分離して細胞沈殿物を分離した。
    [0039] 分離された細胞を生理食塩水で 3 回洗浄 し た後 1x10 '' 釉胞 Z m 1に なる よ う稀积 した。
    [0040] この細跑浮遊液 O.lmJ をマ ウ ス 1 群を 〗 0 匹 に して左側鼠蹊部皮下 移植した 腫瘍細胞移植後 72 時間が経つ た後連続 し て 1G H 間精 製された分割物である蛋白多糖類を投与 した。
    [0041] 対照群には生理食塩水を - 処置群には生理食塩水に溶解させた蛋 多糖類を 20mg/ks の濃度で 0.1 mJ ずつ投与 し た
    [0042] SUBSTITUTE SHEET 腫瘙細胞を移植 してから 30日 目 になる 日 マ ウ ス を致死させ .誘発さ れた固形癌を摘出 した後、 その重量を測定 し て平均腫瘍重量を求め 下記式によ リ腫瘍阻止百分率を計算 し た。
    [0043] C w 1 w
    [0044] 阻止百分率 （I.R.! = X 100
    [0045] Cw
    [0046] I . R ： Percent Inhibition Ratio Cv ： 対照群の平均腫瘍重量 Tw ： 処置群の平均腫瘍重量 このよ う な肉種- 180 を利用 した抗癌実験の結果は表 1 に表わ した よ う に対照群に比 して処置群において最も優秀な効果の有る G9 を 選択 して G 009 と称 し 、 これに対する分析は下記の実験例に おい て行っ た。 表 1. 肉種一 180 を移植 したマ ウ スに対する蛋白多糖類の抗癌効果
    [0047]
    [0048] SUBSTITUTE SHEET G5 1.83 土 0.29 60.7
    [0049] G6 1， 62 土 0.10 65.2
    [0050] G7 0.64 0.22 86.2
    [0051] G8 0.43 0.21 90.7
    [0052] G9 0.17 0.09 96.3
    [0053] GIO 1.40 0.17 69. S
    [0054] G 009 の化学的分析のため総糖はア ン ト ロ ン発色法、 蛋白質顔料は Π—リ ー（Lowry) 等の方法で測定 した後ア ミ ノ 酸、 構成糖鎮を分析 し結果を表 2.3.4 に表わ し、糖類分析ク ロ マ ト グラ ムは第 1 図に - ア ミ ノ酸ク ロマ 卜 グラムは第 2 図に、 I.Kの分析は第 3 図 に表 した， 糖類分析の為の G.L.に（Shimadzu GC 9A , Japan)使用の条件 ： Column 3¾ 0V-17 (80-100) (Mesh shimalite)
    [0055] 3 mm 9 xl Boron silica .e glass column Temperature Column 丄； i0 - 180"U Gradient, Detector 190°C
    [0056] F J o v rate N2 ： 50ml/niln
    [0057] Hz ： 6Gm】/min- (0.6kg/cmz ) Air: SOi /min. (0.6kg/cmz }
    [0058] Attenuation 'J x 24 a . ί . s (ampere full scale)
    [0059] SUBSTITUTE SHEET 表 2. G 009 の多糖類及び蛋白赏総含量
    [0060] 総含量 多糖類 （ ) 蛋白質 (%)
    [0061] G 009 93 5 表 3. G 00 の多糖類部分中単糖類の含量
    [0062] 単糖類 相対比 （2)
    [0063] アル フ ァ一グルコ ー ス 45.8
    [0064] ベ タ ー グルコ ース 41.70
    [0065] カ ラ ク 卜 ー ス 8.03
    [0066] ア レフ ァ ー マ ン ノ ス 3.32
    [0067] フ ラ ク 卜 ース 1. 11 ア ミ ノ酸自動分析器 （Beckman Sys .6300，し S . A )使用 の分析条件
    [0068] し 0 I u in π 2.6 x 200 m I
    [0069] I on exchange res: 5 338076 ( Beckman ) r low rate Buf fer sol uti on 0.33m l/mi n
    [0070] I、ュ nhydri n 0. 17 in 1 / m j n
    [0071] Analysi s c cl e t i m« 60 mi n
    [0072] Co umn pressure 21 O OP S i ( H 7kg/cm )
    [0073] ^ l n y d r i n pressure 100ps i ( 7 kg/cm
    [0074] SUBSTITUTE SHEET Column temperature 50-70°C Gradien-
    [0075] N2 gas pressure 40Psi (2.8kR/cm2)
    [0076] Reaction bath temperature 130 °C
    [0077] Wave length 570nm , 440nm
    [0078] 表 4. G 009 の蛋白質部分中総ア ミ ノ酸含量
    [0079]
    [0080] 実 験 例 2 .
    [0081] G 009 の投与経路に伴う杭癌効果の変化
    [0082] ICR 雄性マウス 20-25g の腹腔内で 1 週間間隔で移植 して継代 し た 肉種 -18ひ 細跑を実験用腫瘍細胞と して使用 し た。 マ ウ ス腹腔で EI間培養させた肉種細胞を腹水と共に ¾つ て水冷， 滅菌 し た： fi塩 、 1
    [0083] を加えて 3000ΓΡΠ で 5 分間遠心分雜 し て細胞沈殿物 を分雜 し た。
    [0084] 分離された細胞を生理食塩水で 3 回洗浄 し た後 U107 細胞ノ《U にな る よ う稀釈 した。 こ の細胞懸 S液を マ ウ ス 1 群を 10匹 に し て 】 X 10ε 細胞 / 0.1ml をマ ウ スの左側鼠蹊部に移植 し た後隔 日 制 た後隔日制で 10 回、 筋肉、 皮下及び腹腔注射は 20Bg/kgを 、 静脈 注射は隔 日 で 5 回 を 1 Oag/kgで投与 し 、 対照群も 同 じ方法で生理食 塩水 Ο. ΐπϋ ずつ投与 して 30 日間経過後固形癌の重量 を測定 して 比較した。
    [0085] 表 5 に表れた如 く 、 全ての投与方法において差異が殆ど無 く 固形 癌の成長を抑制させた。
    [0086] 表 5. G 009 の投与経路に依る抗癌効果の比較
    [0087]
    [0088] 実 験 例 3
    [0089] SUBSTITUTE SHEET G 009 の投与に依る寿命延長効果 マウスの生体内で G 009 の抗癀活性を測定するためエル リ ヒ カ シ シノマ ¾跑 （Ehrlich ascite tu ors ： EAT)を使用 した。 EAT »跑を 1 X 106. 5 X 10' 細跑 Z»l をマ ウ スに腹腔注射して 移植し 24 時間が経 ¾した後 G 009 を蛾 ¾g»塩溶液に溶解 して 100«g/kg の投与量で 12 日間継続して腹腔、 経口投与 し 20 H 、 25 日、 30 日、 50 日の平均寿命を ¾定した。 対照群は生理食塩水 を同量、 同時に投与した。 表 6 に表れているよ う に G 009 の g腔 投与と静脈投与がほぼ似た水準の抗瘡効果を表し、 対照群よ り顕著 な寿命延長効果をもたら した。 表 6. G 009 の投与に依る寿命延長効果
    [0090] 箱飽投与量 マ ウス 疡 ffi跑移植後の観察 E1
    [0091] 数 生存率 ）
    [0092] 20 25 30 40 50 対照群 1 X 106 10 100 40 10 0 0 腹腔投与 1 X 106 10 100 100 80 70 70 静厮投与 5 X 106 10 100 90 70 60 60 対照群 5 X 107 10 100 30 0 0 0 腹腔投与 1 X 107 10 100 60 30 20 20 3
    [0093] 実 施 例 4
    [0094] ト リ ノヽ。ンブル一（Trypan B】 ue)処理したマウスでの G 009 の抗 痛劝果
    [0095] ICR 雄性マウス 20-25g の腹腔内で 1 週間間隔で移植して継代し
    [0096] δ た肉種一 180 «胞を実験用腫瘍細跑と して使用 した。
    [0097] マウス腹腔で 7 日間倍養された肉種一 180 細跑を腹水と共に ¾つ て水冷、 滅菌した食塩水を加えて 4000ΓΡ« で 5 分間遠心分離して ， 細跑沈厳物を分難した。 分離された細胞を生理食塩水で 3回洗浄 した後 ΙχΙΟ7 Λ跑 / :！ になるよ う稀釈して 0.1 1 ずつ マウス鼠
    [0098] 10 接部に皮下注射した。
    [0099] 1 曰経過後 4 g/ ouse(0.4 ; U の Trypan blue を腹腔投与 した. 再 び 1日経 ¾後 1 回に 1 g/ ouse(0.1 1)で 3日間隔で総 13Bg/«ousc になるよう ト リパンブルーを皮下注射し、 ト リパンブルーの投与直 後 G 009 10ig/kg を静 IS注射した。 対照群は G 009 投与の代わ
    [0100] ΙΓ. り生理食塩水で注射して処置群と対照群のマウス数は各々 10 匹に
    [0101] した。
    [0102] 腫瘙移植 30 日経適後マ ウ スを致死させ腫瘙の重量を測定 した
    [0103] SUBSTITUTE SHEET G 009 に対する ト リパンブルー効果に対する上の実験結果は表 7 と同様であ り、 このような実験結果は大食細跑不活性化因子である 卜 リパンブルーを ½理する ことに依り、 本発明の抽出成分である G 009 が抗瘅効果と関連のある大食 »飽を活性化させる こ と を知る ことが出来、 又 G 009 が T - 淋巴球の抗瘙活性と共に大食細胞の の機能を活性化してやる ことに依り抗疡効果を表わすものと見られ
    [0104] る。
    [0105] 表 7. ト リバン ブルー ¾理したマウスでの G 009
    [0106] O の抗癌効果 膾瘙の重量 （g) (Mean 土 S.E ) 対照群
    [0107] G 009 処理群 0. .05
    [0108] ト リパン ブル一《k理群
    [0109] 卜 リバン ブル一 ½理と 2.69 ± 0.17
    [0110] G 009 *理群 .
    [0111] % 施 例 5 新生マウスの ¾腺切除後 G 009 投与と抗胸腺グロブリ ン処
    [0112] 理時の ¾果
    [0113] SUBSTITUTE SHEET 2 日令 ICR マウスの胸 JR切除をスジョ ジン （Sjodin)の方法で施行
    [0114] し、 胸腠切除の 6通後にマ ウス鼠蹊部に肉種一 180を lxlO7細胞 ZmJ
    [0115] の細跑 JSS液を 0·1 1 ずつ移植した。 移植 24 時簡後隔日間隔で
    [0116] 10 回 20 g/kg の投与量で G 009 を筋肉注射した。 胸鰺切除され
    [0117] たマウスの感染防止の為実験期間中テ トラサイ ク リ ンー HCI(Tetra - cycline-HCI)の含まれた給水を してやっ た，
    [0118] 钪胸腠血清の分離は Tadaku a 方法を使用 したと ころ 2-3 週令 の
    [0119] マウスから胸展を切除して胸《»飽を分麵した後 塩 β銜溶液に
    [0120] 稀釈して細跑懸 液に作っ た後 1x10s »跑ノ 1 の胸黟«胞を 3週
    [0121] 間隔で 3回家兎に静脈注射して免疫化させた。 最終注射後 1週間経
    [0122] 過後抗胸蕨血清を取って 56でで 30分不活性化させた。 こ の不活性
    [0123] 化された抗胸腺血清から IgG (免疫グロブリ ン G)分劁をアンモニ ゥ
    [0124] ム スルフェー トで沈嚴させて分離した後 hlO7 細跑/■] の肉種
    [0125] 一 180 が接種されて 1 日経っ たマウスに 10日間 0.1B! の投与量で
    [0126] 腹腔注射し、 G 009 は肉種一 180 移植 1 日 後隔 E!間隔で 20BS/kg
    [0127] の投与量で 5 回筋肉注射した。
    [0128] 上の実験結果が表 8 に表れた如 く G 009 の抗癌効果は T-规跑 の
    [0129] SUBSTITUTE SHEET 機能と関連して胸腠切除されたマウスが対照群よ リ抗癌効果が顕著 に低く、 抗胸滕グロブリ ン »理群でも正常の家兎グロブリ ンのシュ ド（pseudo)-*理群である対照群よ リ抗癀効果滅少されるのを見る ことが出来る。 それ故、 このような実 Ife結果は G 009 が Τ-»飽の 機能を活性化させる ことに依り抗 ¾効果を表すものと見傲される。 表 8. 新生胸展の切除されたマ ウス （実験 1)と抗胸滕グ Πブ
    [0130] リ ン》理 （実敦 2)されたマ ウスに肉種一 180 を移植し た後 G 009 の投与に依る抗癌効果の比較
    [0131]
    [0132] Ν.Μ ： 正常マウス
    [0133] .ή' ： 胸腺切除マゥ ス
    [0134] SUBSTITUTE SHEE- A.T.M ： 抗胸腺グロブリ ン «k理マウス
    [0135] N.R.G.H ： 正常家兎グロ ブ リ ン »理マウ ス
    [0136] 実 験 ^ 6
    [0137] G 009 が補体系に及ぼす影響
    [0138] 補体はギニァ ビグ （Guinea pig)血清と人間の新鮮な血清を使用
    [0139] し 、 赤血球は麵羊赤血球を使用 し、 抗体は抗續羊溶血素 （Anti sheep - he oJysin) ¾：使用 した- 補体系活性実襞は下記の ^如く行った。
    [0140] 試敎管に 150 l のゼラチン ベロナル tt銜液 （GVB2')と試料 50#】 を加えた後、 これに 50 » 1 の補体 （100 units/ )を添加し .37 °C
    [0141] で 30 分間反応させた後、 GVB を加えて補体 *度を 1 unit/nJ に に調整した。 これらの混合物を溶血素 （He olysin ： 2MHU/ _!)に 感作した麵羊赤血球細胞（5χ10β «跑/ 1)2 1ずつ添加し GVB2+溶液 で S整された補体混合物を 1·0 1.2, 1.6 unit を各々加えた後.
    [0142] GVB 溶液で総量が 5B1 になるよう襲整し、 37 で 60 分間反応 させた後 2500ΓΡ で 5 分間遠心分離して得た上澄液の吸光度を
    [0143] 54ίη«ι で測定した。
    [0144] SUBSTITUTE SHEET 活性度は対照群と G 009 の補体消费量 （$)であ り、 表 9 に表れた
    [0145] 如く G ひ 09 の S度に比树して補体消費量が増加し、 このような結
    [0146] 果は G 009が免疫系の重要防 »機能中の一つである補体系の機能を 活性化させてやることに依り免疫増強作用を表すものと考えること が出来る。
    [0147] 表 9. 補体系活性化に対する G 009 の効果
    [0148]
    [0149] 実 験 倒 7
    [0150] 免疫に B§ した》S重景に する G 009 の効果
    [0151] G 009 を 10«gの投与量でマウスに籙脈注射した後 5 日後、 肺. 肝.
    [0152] 脾嗞を摘出して、 これらの重量を測定し、 ライ ゾザィム（Lysozyee)
    [0153] -は燐酸塩接銜溶液 （PH 6.2) で溶解したス ト レプ トコカス リ ソデ
    [0154] イ クス （Streptococcus lysodeicus) を基質.に して反応させた後、
    [0155] SUBSTITUTE SHEET その活性は 660η· で吸光度で翻定した。
    [0156] 表 1 0 で表した通り G 009の »理群において脾 Κの重量と ライ ソザ
    [0157] ィムの活性度が増加 した理由は G 009 が大食細跑を活性化させて
    [0158] ライ ソザィムの活性傭が增加したのであ り， 免疫機能に関連した胂
    [0159] Κの重量が増加したものと見られる。
    [0160] 表 1 0 . G 009 投与による血清酵素活性值と器官重量に関
    [0161] する影響
    [0162]
    [0163] * 各器官の重量は体重に対する相対値
    [0164] 実 験 例 8
    [0165] マウスの港血班形成 数に G 009 が及ぼす影藝
    [0166] 1 ) 実験動物と して 20- 25g の雄性マウス 1群を 5 匹と して試料 を 20g/kg の濃度で連続して 5 日間腹腔注射した。
    [0167] 最後の投与 7 日後、 編羊赤血球を 1 ヌ 1 06 細胞 / B l讒度を腹腔注 射して免疫させた後、 編羊赤血球投与 4 日後脾 IIを摘出 した。
    [0168] SUBSTITUTE SHEET ブレンダー（blender) で永冷の平衡塩溶液と共に粉砕して脾接新胞 を遊 Stさせた。
    [0169] これを 2000ΓΡ« で 5 分間遠心分酸して、 上澄液を除去し、 赤血球 を除去するため 0·83 Ϊ 塩化アンモニゥム溶液に浮遊させて 37
    [0170] で 3 分間放置した。
    [0171] 再び遠心分重して水冷の平衡塩溶液に浮遊させた後、 赤血球除去脾
    [0172] Κ«鹿数を血球計で S定した。
    [0173] 2) ァルセベル溶液 [葡萄糖 2(L5g，塩化ナト リ ウム 4.2g,构樣酸 ナト リ ウム 8.0g を IL の蒸留水に溶解した後、 ミ リポア *過器
    [0174] (0.45 μ■) で ¾¾して使用] に懸 Sされた緩羊赤血球を平衡塩溶 液で 2000ΓΡΒ で 5 分間 4 回反復して洗浄し、 最終濃度が lO!S に なるよう？^塩榕液に浮遊させた。
    [0175] 3) 平板皿に 1.52 Τ Λ'— (Noble agar,Difco.) 10·1 を注いで基
    [0176] 底層平板を作った。 再び 0.72 ァガー 2 1に 1)の肆1¾細胞 1U0 μ 1 と 2)の解羊赤血球 ΙΟΟ Α Ι を混合した後、 平板皿に注ぎ均一 に広がるよう にした。
    [0177] これを 37 で 60 分間感作化させた後、 補体と して吸収された
    [0178] SUBSTITUTE SHEET 二ァ ピグ血清を平衡塩溶液に 10倍秣釈して 2.5iil ずつ加えて 37て で 30 分間培養した後、 形成された溶血班形成細跑数及び牌 R細跑 全体中の榕血班形成細飽数 （PFC/牌接） を計算して表示した。
    [0179] 表 11 に表れた結果から見て G 009が全体碑«細胞数及び溶血班形
    [0180] 5 成細胞数の穎著な増加原因を招来するので免疫増強作用に閱連して
    [0181] いる こ と を知る こ と が出来る 。
    [0182] 表 11. 麵羊赤血球で免疫された ICR マ ウ ス脾 β内の溶血班形成
    [0183] »跑に及ぼす G 009 の効果
    [0184] 10
    [0185] In
    [0186] 実 施 例 9
    [0187] 免疫剌戟作用
    [0188] 毎グループ当 10 匹に して生後 6 週になっ た 20-25g の雄性 ICR
    [0189] 系マ ウ スを使用 した。 G 009 を生理食塩水に溶解し、 各 «度刖溶
    [0190] 2U 液 0.2ml をマ ウ スに腹腔内投与する。 投与後 24時間に In] のべ
    [0191] SUBSTITUTE SHEET リ カン Π Γ ング イ ンク ] 7 ブラ ッ ク (Perican Drawing Ink
    [0192] 17 Black,Gunther-Wagner Co.，Ltd.製造） と 3 （V/V) のゼラチン を含有する生理食塩水 2«i を握合して g造した炭素颺 S液 0.2 id をマウスの尾に静 K注射した後 1, 5， 10 及び 15 分にへパリンで 被 δされたへマ トク リ ト毛 »管を利用 して で血液 0.02»1 を採 取して直ちに 0· Ι2 (V/V)の炭酸ナ ト リ ウム水溶液 1.6Β1 に稀釈及 び溶血させる . この溶液を 675η· で比色させ食作用指数 （ Κ值） をハルペルン等 (Halpern et al) の等式によ リ溷定する。
    [0193] 対照群はマウスに生理食塩水 0.2羅1 を投与する。 log Co 一 log C
    [0194] K =
    [0195] t - to
    [0196] 上記式で ^ Co = to 時間での血液中の炭素粉末含量であ り
    [0197] C = t 時間で血液中の炭素粉末含量である。
    [0198] 上の試験に対する結果を表 12 に表 し G 009 の濠度に比例して免 疫食作 ffl指数 (K) が高く表れており 、 このような結果か
    [0199] SUBSTITUTE SHEET ら見て G 009 が免疫反応に関与して免疫増強作用を表すものと見
    [0200] られる
    [0201] 表 12. 免疫刺戟作用に対する G 009 の影響
    [0202]
    [0203] 実 験 例 10
    [0204] G 009に対する急性毒性試験はマウス、 ラ ッ ト 家兎に対して行い、
    [0205] G 009 投与後 14 日 目 に測定した。
    [0206] 表 13 に表れた如く投与経路や種 （species) に対しても致死は無
    [0207] かっ たので G 009は毒性が極めて低い安全な物賓である。
    [0208] 表 13. G 009 に対する毒性試験結果
    [0209] SUBSTITUTE SHEET 10 50 - 100 i . D 0 > 100
    [0210] 10 1000 -2000 s . c 0 > 2000 n
    [0211] 10 一 oUU 1. V u >
    [0212] Rat 1U c n Λ I UUU 1. P U -、 n n
    [0213] J UUU
    [0214] 10 50 - 100 1. n 0_ > 100
    [0215] 10 500 - 1000 s · c 0 > 1000
    [0216] 10 100 - 200 i · v 0 > 200
    [0217] Rabbit 10 100 - 200 i. G > 200
    [0218] 10 25 - 50 i.a 0 > 50
    [0219] 10 50 - 100 s. c 0 > 100.
    [0220] 実 驗 例 11 苗稀- fSお feJt齩 本発明者等は全国各地域で採取したガノデルマ ルシダム (Ganoder.a lucidum) 菌株の抗 «効果を検索して見た結果、 抗 効 果が優秀であると判断される 4 種と標準菌種 （農村接與庁 農業 技術研究所 菌茸課保有） の系弒間分類及び生理遺伝的差異を糾明 するため下記の如き実驗を行っ た。 実 ϋ材料及び方法 使用菌株、 培地及び培萎 本実験に使用 した菌株は国内で自生するガノデルマ ルシタム （霊 芝， Ganoder麗 a iucidun)中抗癌効果が優秀であると判断される 4脔 株を使用 し、 収集頹は表 12 の通りである。
    [0221] SUBSTITUTE SHEET 試料の抽出
    [0222] 液内培養した培養物を遠心分 Siして得られた菌糸体を熳酸塩緩街塩
    [0223] 類液 ( phosphate buffered saline ： ρΗ 7·5)に 3 回洗净した後、
    [0224] 菌糸体を氷冷下に 30 秒間超音波 »理した。
    [0225] これを 12000Xg で遠心分離した後、 上澄液を電気泳動試料と して
    [0226] 使用 した。
    [0227] 蛋白質定量
    [0228] 試料中の蛋白質は牛血清アルブミ ン （BSA)を標準物質に使甩して
    [0229] BCA 蛋白分析試薬. (Protein Assay Reagent , Piece Co-)を使用 して
    [0230] 定量した。
    [0231] 電気泳動
    [0232] 気泳動は不連綾緩銜系 (discontinuous buffer system )を利用 し
    [0233] た。 分蹙ゲル （separating gel) は 240覼 H Tris-Cl緩銜液（PH 8.8) に 10$ T, 103； C 濃度に し、 スタ ッ ク ゲノレ （ stacking Eel )は
    [0234] Tris 接癬溶液（39.5BM Tris, 0.064N H3 P0 PH 6 · 9 )に 3.125 丁，
    [0235] 25$ C 療度でゲルを調剤した。
    [0236] ゲルを固化させるため TEMEDと アンモニ ゥムスルフ エ 一 ト を使用 し
    [0237] SUBSTITUTE SHEET た。
    [0238] ランニング 接衝 (running buffer) で陽極には 40 M ト リス - グリ シン緩 «液 （PH 8.8) を、 陰極には 60nM ト リ スー C1緩銜液
    [0239] (pH 7.47)を使用し、 試料は 70 g ずつをゲルに装填 （loading)し て 4てで 100V で 2 時間の間展開した。
    [0240] ゲルの染色
    [0241] (1) エステラーゼ （E. C. 3, 1 , 1, 1)
    [0242] 展開したゲルを 0.2M 攝蒙塩 β»液 （pH 6.5)に 30 分間沈漬させ た。 沈癀される簡、 新しい S銜液で 3 回交換してやった。 沈漬の 終わったゲルの酸度を調整した後、 発色液
    [0243] ( a -naphthyJacetate 20 8， ethylene glycol ono ethyJ ether
    [0244] 2el,fast blue RR salt 20 0.2M phosphate buffer 120
    [0245] を加えて暗い場所で 35"Cで 30 分間徐々に振ってやりながら発色 させた。 - (2) アン ド ホスファ タ一ゼ （E. C. 3， 1， 3, 2)
    [0246] ゲルを 0·ΙΜ 醋酸塩接 *液 （PH 5.2) 沈清してゲル内の酸度を調整 した後、 発色液（102 Hg02, 溶液 Bnl.fast garnet GBC salt 70 BSTITUTE SHEET a -naphthylphosphate 80 g， β -naphthy lphosphate 80 g, 0.1M
    [0247] acetate buffer 100 1) を加え 37でで 30 分間発色させた。
    [0248] (3) ロイ シン ア ミ ノぺプチダーゼ （E.C.3，4,11，1)
    [0249] ゲノレに 16色液 一: leucyJ一 P一 naphthyla ide HC1 20 g， fast black
    [0250] K salt 20 8， distilled water 50 ; 1， 0.2H Tris alate buffer
    [0251] (pH 5.4) 120.1] を加えて暗い場所で 30 分間発色させた。
    [0252] (4) ぺ 13 キシダーゼ （E.C.I, 11, 1,7)
    [0253] ゲノレを水洗した後、 究色液 (Benzidine lg, acetic acid 9
    [0254] ixed solution of 1 art of benzidine solution ixed with
    [0255] 40B1 of distilled water, 1 part of 0.03¾ HZ0Z and 4 parts of distilJed water)を加えて暗い場所で発色させた。
    [0256] このよ う な実 «結果を説明すれば下記の通りである。
    [0257] エステラーゼの同位簾素パタ ーン（pattern)
    [0258] 霊芝のエステラーゼ バン ド （esterase band) は第 1 国における
    [0259] と同 じ く総計 17 個が表れたが 5 と 】 5 番目のバン ドは全ての脔
    [0260] 株で殆ど共通的に見えた。 標準菌株である Fr 0700 と Fr 07008
    [0261] 及び IY 005 菌株のエステラーゼ パタ ーンは極めて類似してたが、
    [0262] SUBSTITUTE SHEET I Y 009 と I Y 010 菌株のエステラーゼ パターンは他の菌株と大 きな差異のあること を知る ことが出来た。
    [0263] ァシ ド ホスフ ァ タ ーゼの同位酵素パタ ーン
    [0264] 第 5図に.表れたよう に標準株菌 Fr 07004 , Fr 07008 及び I Y 005菌 株のァシ ド ホスフ ァ タ一ゼのパターン間には極めて類似した様相 を表したが、 π 009 と ιγ 010 の場合は他の菌株とは相違したバ
    [0265] ン ドのパタ ーンを見せた。
    [0266] ロイシン ア ミ ノぺプチダーゼの同位酵素パターン
    [0267] 霊芝では全部 3 儀のロイシ ン ァ ミ ノぺプチダーゼ バン ドが表れ たが、 このうち標準菌株である Fr 07004 , Fr 07005及び I Y 006は 大部分同様な様相を表したが、 Π 009 はこれら とは全く異なる様 相を表した （第 5国） 。
    [0268] ぺロキシダ一ゼの同位酵素パターン
    [0269] 霊芝菌株では 2 僮のぺロキシダーゼ バン ドが表れたが標準葑株で である Fr 07004， Fr 07008及び I Y 005 の間には由縁関係が多か つた （第 5囡） 。
    [0270] 菌種間の由緣関係
    [0271] SUBSTITUTE SHEET C 表 14 に表れているよ う に， 翥芝の標準菌株である Fr 07008 と
    [0272] IY 005 の間には 93.8¾ Fr 07004 と IY 005 は 82.42 の高い由 縁関係を見せているが， Fr 07004と TY 010及び Fr 07004と Fr 009 は各々 30.42 と 31·8Ϊ の比較的低い由緣閣係を見せた 以上のよ うな閟係から同一種内の同位酵素パターンの差異は地理的
    [0273] S境の差異に伴う遍伝的変異によ り生化学的変化を誘発する こ と に 依 り表れる こと を知る こ とが出来、 このよ う な差異が苗株毎に抗瘙 活性が異なる蛋白多糖体を生成する こ と と関速のあるものと ¾られ る
    [0274] J 0 表 】4. 本実験に使用された菌株の採取地域 種名 菌株番号 ' 採集地 儼考
    [0275] Fr 07004 農村振興庁保有 標準菌株
    [0276] 15 1 UCJ dun Fr 07008 農村振興庁保有 標準菌株
    [0277] I ¥ 005 京 *道光陵
    [0278] IY 008 全南 頭 山
    [0279] 1Y OOP 全南 頭倫山
    [0280] IV 010 江原道雉岳山 ！ . エステラーゼ . マシ ド ホ ス 。タ ーセ . ロ イ シン
    [0281] ァ ϊ ノ ぺプチタ 一ゼ ぺ ロ キ シダーセ' 'タ ー
    [0282] SUBSTITUTE SHEET に依る霊芝 （Ganoder a lucidun) 菌株間の類似性 比較
    [0283] 薪似性 (%)
    [0284] 菌株番号 Fr 07004 Fr 07008 IY 005 IY 008 IY 010 IY 009 苗種名
    [0285]
    [0286] SUBSTITUTE SHEET
    权利要求:
    Claims
    特許請求の範囲
    ガノデルマ ルシダム を培養し、 これから分越された糖成分と して ベタ -ダルコ -ス、 アルフ ァ -グル-コ ス、 ガラ ク トース、 アルフ ァ一 マン ノ -ス、 フ ラ ク トースを含有し、 蛋白成分と してグラ イ シン、 ライ シン， ァラニン、 ヒ スチジン、 アルギン、 ノ リ ン、 ァスバルチ ッ ク ァシ ド、 卜 レオニン、 イ ソ ロイ シン、 セ リ ン、 ロ イ シン、 グ ルタ ミ ッ ク ァシ ド、 チシン、 プロ リ ン、 フ エ 二ルァラ ニ ン、 メチ
    ォニンを含有し、 抗雇瘙免疫増強効果を持つ蛋白多糖体 （G 009 )。
    SUBSTITUTE SHEET
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